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植物提取物理化分析之色谱鉴定法

2010-04-10 15:29:39 浏览次数:0

         色谱鉴定法    又称“层析法”,根据其分离原理,有吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱与排阻色谱(size exclusion chromatography)等。吸附色谱是利用被分离物质在吸附剂上被吸附能力的不同,用溶剂或气体洗脱使组分分离,常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。分配色谱是利用被分离物质在两相中进行分配使组分分离,其中一相为液体,涂布或使之键合在固体载体上称为固定相;另一相为液体或气体称为流动相,常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。离子交换色谱是利用被分离物质在离子交换树脂上的离子交换作用使组分分离,常用的有不同强度的阳、阴离子交换树脂,流动相一般为水或含有机溶剂的缓冲液。排阻色谱又称“凝胶色谱”或“凝胶渗透色谱”,是利用被分离物质分子量大小不同在填充剂上渗透程度不同使组分分离;常用的填充剂有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等,可根据载体和供试品的性质选用水或有机溶剂为流动相。分离方法有柱色谱法、纸色谱法(paper chromatography,PC)、薄层色谱法(thin-layer chromatography,TLC)、气相色谱法、高效液相色谱法等。色谱法反映的是中药提取物化学组成及含量情况,能定性定量地反映中药的鉴别特征,具有分离能力·强、分析速度快、定量准确等特点。在进行色谱鉴定时,所用溶剂应与供试品不起化学反应,除另有规定外,应用纯度较高的溶剂;色谱时的温度;除气相色谱法或另有规定外,系指在室温条件操作。

(1)柱色谱法  是利用中药中的化学成分在柱层析上层析发生分离、及其分离后各组分尺+值的不同进行鉴别。柱色谱包括吸附色谱和分配色谱。供试品可溶于固定液,混以少量载体,加在预制好的色谱柱上端。流动相需先加固定液混合使之饱和,以避免洗脱过程中两相分配的改变。

(2)纸色谱法  纸色谱法是利用中药中的化学成分在特制层析用滤纸上层析发生分离、及其分离后各组分Rf值的不同进行鉴别。本法是以纸为载体,以纸上所含水分或其他物质为固定相,以流动相进行展开的分配色谱。所用滤纸应质地均匀平整,具有一定机械强度,必须不含影响色谱效果的杂质,也不应与所用显色剂起作用,以致影响分离和鉴别效果,必要时可进行处理后再用。 

(3)薄层色谱法  是将适当粒度的吸附剂均匀涂铺在玻璃板上(或其他支持物上,如铝制薄板)成一薄层,然后用毛细管或适当的点样器将样品液滴加在薄层的起始线上,待样点上的溶剂挥散后,置于密闭的色谱缸中,用一定的溶剂展开,当溶剂前沿到达距离另一端2-3cm处,取出,干燥,显色。样品中的混合物被分离,各成1个色点,测量起始线至各色点中心的距离,计算各色点比移植。薄层色谱的特点是展开时间短,分离效果好,灵敏度比纸色谱高,而且显色方便,可以直接喷洒腐蚀性的显色剂,并可加热进行鉴定。

(4)高效液相色谱法  高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)的原理与一般液相色谱十分相似,流动相均为液体,包括有液—固色谱、凝胶色谱、离子交换色谱和液—液色谱。高效液相色谱法的流动相是具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等,用泵将流动相压入装有填充剂的色谱柱,注入供试品(被流动相带入柱内),在填充剂上分离后,各成分先后进入检测器,用记录仪记录色谱图。河南中冠健业生物科技有限公司所用的仪器为液相色谱仪,常用的色谱柱填充剂有:硅胶(用于正相色谱)、化学键合固定相(根据键合的基团不同用于反向或正相色谱;如十八烷基硅烷键合硅胶常用于反向或离子对色谱)、离子交换填充剂(用于离子交换色谱)、凝胶、玻璃微孔球(用于排阻色谱)等。样品注入量一般为数微升,柱温多为室温,紫外检测器。

本法与普通色谱法相比具有高速化或高效化的特点;与气相色谱法相比,因流动相为液体,固体样品只要求制成溶液,不需要气化,因而具有不受样品挥发性限制的优点,适用范围广。所以,本法可适用于中药中各类成分的鉴定。
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